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La genética molecular de los eucariotas

El cromosoma eucariótico
El genoma eucariótico
La regulación de la
expresión génica en
los eucariotas

Transcripción, procesa-
miento de mRNA y síntesis
de proteínas en eucariotas

Genes en movimiento
Genes virus y cáncer
Transferencia de genes
entre células eucarióticas

Capítulo 17. La genética molecular de los eucariotas

Transferencia de genes entre células eucarióticas

La transferencia de genes § entre células comenzó cuando se quizo lograr que el genoma de las células eucarióticas § incorporara en forma estable un DNA § extraño y que éste se expresara en ellas. En el primer experimento de este tipo, se usó un virus § como vector §.

Posteriormente se encontró que, al exponer las células en cultivo a DNA purificado, precipitado con ion calcio (Ca2+), se estimula la captación de DNA. Aparentemente, algunas células (aproximadamente una en un millón) fagocitan el precipitado e incorporan el DNA. Pero surge el problema de identificar y seleccionar las células que han incorporado a su genoma el DNA extraño.

Existen métodos que facilitan la selección de las células que han incorporado el DNA extraño. En general, todos se basan en introducir en las células el gen extraño junto con un gen llamado “gen marcador”. La incorporación y expresión del gen marcador, que puede ser un gen de resistencia a un antibiótico, confiere a las células la capacidad de crecer en un medio selectivo que frena el crecimiento de las células que no han incorporado el DNA.

Actualmente, la transferencia de DNA a células eucarióticas en cultivo, transfección §, se realiza por varios métodos.

El desarrollo exitoso de técnicas para introducir genes en células en cultivo abrió nuevas posibilidades que llevaron al desarrollo de metodologías que permitieron introducir genes en animales. Esta idea se convirtió en realidad. Un animal que incorpora información genética nueva, por agregado de DNA extraño, se denomina transgénico § y el gen incorporado se denomina transgén.

Por medio de la técnica de microinyección, se introdujeron genes extraños en óvulos fecundados. Esos genes extraños introducidos se han expresado en los organismos que se desarrollaron a partir de esos óvulos.

Por ejemplo, se combinó el gen de la hormona de crecimiento somatotropina humana con la porción reguladora de un gen de ratón y se inyectó en óvulos fecundados de ratón. Los ratones transgénicos resultantes crecieron hasta el doble del tamaño normal, indicando que el gen humano se había incorporado al genoma del ratón y estaba produciendo hormona de crecimiento. Dado que el DNA se había inyectado en los óvulos, apareció en todas las células, incluyendo las células germinales, y así pudo ser transmitido a la generación siguiente.

Estas dos hembras de ratón, son crías pequeñas de la misma camada. El óvulo fecundado del que se desarrolló la hembra de la izquierda fue inyectado con un gen que consistía en las secuencias promotora y reguladora de un gen de ratón combinadas con el gen estructural de la hormona de crecimiento humana.

Después de la integración, el nuevo gen en el genoma de la hembra de ratón de la figura anterior se transmitió a su progenie. En promedio, los ratones que expresan el nuevo gen crecen de 2 a 3 veces más rápido que los ratones que carecen de él y, como adultos, tienen el doble del tamaño normal.

 

Este tipo de procedimiento ha sido llevado a cabo con varios genes clonados. En general, la incorporación del gen extraño se produce por recombinación en sitios al azar. En uno de cada mil de esos eventos, el gen extraño reemplaza a su homólogo en el genoma receptor por recombinación homóloga. Del 10 al 30% de los óvulos fecundados sobrevive a la manipulación y el gen extraño funciona en un 40% de este porcentaje. La técnica de microinyección de DNA directamente en óvulos fecundados tiene por lo tanto limitaciones.

Posteriormente, fue desarrollada en ratones una metodología alternativa para introducir genes en embriones en desarrollo. Se encontró que células de un embrión temprano de ratón, en estado de blastocisto §, podían proliferar en un cultivo realizado in vitro. Estas células especiales, denominadas células embrionarias totipotenciales (ES), pueden ser mantenidas en cultivo en condiciones adecuadas que evitan su diferenciación. Si son reintroducidas en un blastocisto, se diferencian y contribuyen al desarrollo del organismo participando en la formación de los tejidos. Aprovechando la capacidad de estas células embrionarias de mantener sus características en cultivo, se puede introducir en su genoma DNA extraño por los métodos de transfección.

Esta metodología permite la introdución de modificaciones mucho más específicas y es, por lo tanto, mucho más eficiente que la microinyección en el desarrollo de ratones transgénicos.

El desarrollo de animales transgénicos hizo posible abordar el estudio en mamíferos de la expresión diferencial de genes en distintos tejidos durante el desarrollo §, establecer modelos para el estudio de enfermedades humanas y probar potenciales agentes terapéuticos. Una de las alternativas interesantes es el uso de animales transgénicos como biorreactores para la producción de proteínas farmacológicamente importantes de uso humano. La fusión del gen extraño con un fragmento de DNA que contiene la región regulatoria de una proteína que normalmente está presente en la leche del animal permite que el gen de interés se exprese específicamente en la glándula mamaria del animal transgénico y que su producto proteico se secrete en la leche.

Recientemente se ha desarrollado en mamíferos una metodología que permite obtener clones § de animales. Esta metodología se basa en la transferencia del núcleo § de una célula en cultivo a un ovocito § no fecundado al cual previamente se le extrajo su material genético. El ovocito anucleado es sometido a un pulso de corriente que simula la estimulación que proporciona el espermatozoide y se fusiona con la célula dadora del núcleo. Algunos de los ovocitos fusionados comienzan a desarrollarse como un embrión normal y son implantados en una madre sustituta. En los primeros ensayos, realizados en ovejas, las células dadoras del núcleo fueron células de embriones tempranos (9 días) en cultivo. Los ovocitos que recibieron el núcleo de estas células se desarrollaron en organismos adultos. Más recientemente, se realizó con éxito el mismo procedimiento con células somáticas en cultivo de una oveja adulta. De este experimento nació Dolly, el primer mamífero clonado a partir de un adulto. El éxito de esta metodología se basa en coordinar los ciclos de replicación del DNA y los de producción de mRNA § de ambas células. Para esto, las células dadoras del núcleo son cultivadas, previo a la fusión, en un medio con escasa cantidad de nutrientes, que lleva a las células a mantenerse en las fases G0 o G1 del ciclo celular §, en las cuales no hay replicación de DNA. De este modo, durante las primeras divisiones del embrión en desarrollo, se expresarán únicamente las proteínas codificadas por el mRNA presente en el citoplasma del ovocito. Esto permite la reprogramación del núcleo por interacción con las proteínas regulatorias del ovocito receptor.

La posibilidad de obtener clones a partir de células en cultivo facilita el desarrollo de animales genéticamente modificados (transgénicos). La ventaja de esta técnica respecto a la de la microinyección es la mayor eficiencia en la obtención de animales transgénicos y la posibilidad de crear múltiples “copias génicas” de organismos portadores de la misma modificación genética.

Metodología para introducir genes en embriones en desarrollo.

Esquema del proceso que permitió clonar un mamífero a partir de una célula adulta.

 

También se ha realizado en forma muy exitosa la transferencia de genes usando transposones a embriones de Drosophila. Estos son los primeros indicios de que los transposones podrían convertirse en vectores útiles.

 

Autoevaluación del capítulo 17

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