Aislamiento de
fragmentos
específicos de DNACapítulo 16. DNA recombinante: Las Herramientas del Oficio
Secuenciación del DNA
La secuenciación del DNA § es la determinación de la secuencia de nucleótidos § de una molécula de DNA. Se usan dos técnicas principales de secuenciación: una implica métodos enzimáticos y la otra métodos químicos.
La secuenciación depende de la disponibilidad de copias múltiples de un fragmento de DNA, obtenidas por clonado de un segmento producido por digestión con enzimas de restricción § o por la técnica de PCR §. Esta técnica se vale de oligonucleótidos sintéticos y de una DNA polimerasa termoestable.
Combinando la información de la secuenciación de distintos fragmentos del mismo DNA producidos por diferentes enzimas de restricción, los biólogos moleculares pueden determinar la secuencia completa de un segmento largo de DNA (como por ejemplo un gen entero).
Existen dos métodos de secuenciación. En la secuenciación de un segmento de una molécula de DNA por el método de Maxam y Gilbert, el segmento de cadena simple (presente en múltiples copias) se marca radiactivamente en el extremo 5'. La solución § que contiene al DNA marcado se divide en cuatro porciones, cada una de las cuales se somete a un tratamiento químico diferente para romper las moléculas § en una sola de las cuatro bases nitrogenedas §. Con los fragmentos resultantes se realiza una electroforesis en un gel de poliacrilamida desnaturalizante, en el que se separan fragmentos que difieren incluso en un nucleótido de longitud. Combinando la información obtenida con cada reacción, se puede inferir la secuencia del segmento completo.
En la secuenciación por el método enzimático, se procede en varias etapas. En una primera etapa, el oligonucleótido iniciador marcado radiactivamente se aparea con el DNA de simple cadena a secuenciar y se inicia la síntesis de la cadena complementaria por parte de la DNA polimerasa. La mezcla en la que se producirá la reacción de síntesis se separa en 4 tubos, cada uno de los cuales contiene, además, uno de los nucleótidos terminadores (ddATP, ddCTP, ddGTP o ddTTP). Estos son dideoxinucleótidos que carecen del OH- en la posición 3’, por lo que, una vez que son agregados a la cadena que se está sintetizando, no pueden reaccionar con ningún otro nucleótido y se transforman, así, en el último nucleótido de la cadena.
En una segunda etapa, los productos de reacción son sembrados en la parte superior de un gel, en “calles” separadas. Luego de la corrida electroforética, se realiza la autorradiografía del gel que permite leer la secuencia complementaria del DNA original. En el recuadro que se encuentra a la izquierda de la fotografía del gel, que esquematiza la cuba electroforética, se señalan las posiciones de los fragmentos de DNA de una porción aumentada del gel. Las posiciones de los fragmentos de DNA permiten leer la secuencia de nucleótidos incógnita de la sigueiente manera: por ejemplo, si el un fragmento de un solo nucleótido, que se ubica en la primera posición en la calle correspondiente a la guanina indica que el primer nucléotido de la secuencia contiene, como base nitrogenada, una guanina.
De la misma manera, si buscamos en qué calle se ubica el fragmento de dos nucleótidos, verificaremos que el segundo nucléotido de la secuencia contiene, como base nitrogenada, también una guanina. De esta manera, se puede deducir, a partir de la ubicación de los fragmentos en el gel, la secuencia de nucleótidos complementarios de la cadena incógnita. La secuencia completa de nucleótidos se presenta a la derecha del recuadro que esquematiza el gel y es: 5’ GGACAATTGT 3’.
La secuenciación depende de la disponibilidad de copias múltiples de un fragmento de DNA, obtenidas por clonado de un segmento producido por digestión con enzimas de restricción § o por la técnica de PCR §. Esta técnica se vale de oligonucleótidos sintéticos y de una DNA polimerasa termoestable.
Combinando la información de la secuenciación de distintos fragmentos del mismo DNA producidos por diferentes enzimas de restricción, los biólogos moleculares pueden determinar la secuencia completa de un segmento largo de DNA (como por ejemplo un gen entero).
| Capítulos relacionados |
|---|
|