DNA recombinante: Las Herramientas del Oficio
Aislamiento de
fragmentos
específicos de DNA Obtención demúltiples copias de DNA Localización defragmentos específicos deDNA: hibridaciónSecuenciación del DNABiotecnologíaTransferencia de genesTransformación de bacterias y localización de un segmento de DNA de interés por medio de una sonda radiactiva.
Capítulo 16. DNA recombinante: Las Herramientas del Oficio
Localización de fragmentos específicos de DNA: hibridación
Un fragmento de interés se puede identificar mediante técnicas de hibridación de ácidos nucleicos § que dependen de la capacidad de una cadena simple de RNA o de DNA (que puede ser separada de la doble hélice por calentamiento) para combinarse o hibridar con otra cadena que tiene una secuencia de nucleótidos § complementaria. Cuanto mayor sea la similitud entre las secuencias de nucleótidos de las dos cadenas, más rápida y más completa será la hibridación.
- Las bacterias competentes se transforman con plásmidos que contienen distintos fragmentos de DNA obtenidos por digestión de un DNA genómico con una enzima de restricción. Los plásmidos contienen, además, un gen de resistencia a un antibiótico que se usará para la selección de las colonias que hayan incorporado el plásmido.
- Las bacterias transformadas son distribuidas en una placa de Petri con un medio de cultivo sólido que contiene el antibiótico de selección. Sólo las bacterias que hayan adquirido el plásmido recombinante crecerán formando colonias aisladas. Cada colonia se origina por divisiones sucesivas de una única bacteria inicial y todas las células de una colonia contienen el mismo plásmido recombinante.
- Algunas bacterias de cada colonia son transferidas (blotting) a un filtro especial obteniéndose una réplica. La réplica es tratada con una solución de alto pH para romper las células y desnaturalizar el DNA del plásmido. El DNA se une químicamente al filtro
- El filtro con el DNA desnaturalizado es incubado en una solución que contiene una sonda radioactiva que consiste en una molécula de DNA o RNA de cadena simple, complementaria al segmento de DNA de interés. Se permite que la sonda se hibride.
- Se lava del filtro el exceso de solución que contiene las sondas que no han hibridado. Las moléculas de doble cadena que se hayan formado permanecen en su lugar en el filtro y su visualización se realiza por medio de autorradiografía, técnica en la cual primero, cada filtro es cubierto con una película fotográfica y dejado en la oscuridad. Durante el período de exposición, el radioisótopo libera energía que impacta la emulsión fotográfica. Luego del revelado de la película, la posición del fragmento radioactivo se observa como una marca oscura, producida por un depósito de plata de la emulsión. Las réplicas de las colonias que estén marcadas con la sonda radiactiva después de este tratamiento, identifican las colonias originales que contenían vectores con el segmento de DNA que se deseaba estudiar.
Existe también una técnica que permite localizar secuencias específicas de DNA o RNA en células y tejidos mediante el uso de sondas de ácidos nucleicos. Esta técnica, conocida como hibridación in situ, permite, por ejemplo, localizar una determinada secuencia en un cromosoma §. Las sondas, que también pueden ser marcadas con un colorante fluorescente, son hibridizadas a los cromosomas, expuestos previamente a un alto pH § que rompe las uniones puentes de hidrógeno § y separa las dos cadenas de DNA.
El método de hibridación in situ también puede ser usado para detectar la presencia de moléculas de RNA específicas en células de distintos tejidos e indicar, de esta manera la expresión diferencial de genes en esos tejidos.
Hibridación in situ. Cromosomas humanos en metafase, en los cuales se identifican secuencias específicas de nucleótidos mediante la técnica de hibridación in situ de ácidos nucleicos.
En la hibridación in situ, las sondas están marcadas con colorantes fluorescentes. Cada color indica la localización de una secuencia de DNA diferente: rojo, localización en el cromosoma X del gen de la distrofia muscular infantil mas común; verde, región del cromosoma 21 donde se encuentra el gen responsable del Síndrome de Down; blanco, un oncogen en el cromosoma 8; violeta, un gen que codifica una proteína de membrana de los glóbulos blancos; amarillo, una secuencia sin determinar en el cromosoma 5.
En los últimos años, se ha desarrollado una técnica que promete generar un salto cualitativo en los estudios de la expresión genética. Se trata de los microarreglos o chips de DNA que permiten monitorear la expresión de un genoma en forma integrada y en un tiempo récord.
La base de la técnica es simplemente la hibridación de secuencias complementarias de ácidos nucleicos a una escala microscópica. Este altísimo nivel de miniaturización permite que la cantidad de sonda requerida sea mínima Con el empleo de diferentes "etiquetas" fluorescentes se pueden comparar los patrones de hibridación de dos tipos celulares cualesquiera encontrando rápidamente aquellos genes que poseen un patrón de expresión diferencial. De este modo es posible detectar genes específicamente activados en células que han sufrido algún tipo de diferenciación, como células de diferentes tejidos, tumorales, sometidas a ciertos tratamientos, etc.
Los microchips proveen una revolucionaria herramienta para explorar la expresión génica y el análisis de secuencias tanto en la investigación básica como aplicada.
| Capítulos relacionados |
|---|
|