DNA recombinante: Las Herramientas del Oficio

Aislamiento de fragmentos
específicos de DNA
Obtención de
múltiples copias de DNA
Localización de
fragmentos específicos de
DNA: hibridación
Secuenciación del DNA
Biotecnología
Transferencia de genes

La enzima de restricción EcoRI escinde este plásmido en la secuencia GAATTC, dejando extremos "pegajosos" expuestos.

Capítulo 16. DNA recombinante: Las Herramientas del Oficio

Obtención de múltiples copias de DNA

La maquinaria para duplicar DNA § ya estaba presente en la E. coli y en otras células bacterianas. Pero hacían falta vectores § que pudiesen llevar las moléculas de DNA de interés al interior de estas células e iniciar la replicación. Nuevamente, los procariotas § y los virus § aportaron la solución.

Los clones, en genética molecular, son copias múltiples de la misma secuencia de DNA. Las secuencias a ser clonadas se introducen en células bacterianas por medio de vectores. Los plásmidos § y los bacteriófagos § se usan como vectores; los cósmidos § son vectores sintéticos que combinan características del fago lambda (que tienen los extremos cohesivos o regiones COS) con propiedades de los plásmidos. La secuencias de DNA que se desean clonar deben ser insertadas en los vectores. Una vez en la bacteria, el vector y el DNA extraño que lleva se replican y las copias múltiples pueden ser recuperadas de las células.

Para clonar genes específicos se puede preparar una biblioteca genómica §que consiste en una colección de fragmentos de DNA genómicos §, clonados en vectores (plásmidos, bacteriófagos o cósmidos), que representan el genoma § entero del organismo. Otra alternativa son las bibliotecas de cDNA § que representan la colección completa de los mRNA § que se sintetizan en un momento en una célula dada.

Los extremos pegajosos, formados por secuencias TTAA y AATT, pueden unirse con cualquier otro segmento de DNA que haya sido escindido por la misma enzima. Así es posible insertar un gen extraño en el plásmido. (En este diagrama, la longitud de las secuencias GAATTC se ha exagerado y las longitudes de las otras porciones del gen extraño y del plásmido se han acortado). Cuando estos plásmidos recombinantes, que llevan un gen extraño, se incuban en ciertas condiciones con bacterias en medio líquido, son captados por algunas de las células bacterianas. Cuando estas células se multiplican, los plásmidos también se replican; el resultado es un número creciente de células, todas sintetizando copias del mismo plásmido. Los plásmidos pueden separarse luego de los otros contenidos celulares y tratarse con EcoRI para liberar copias múltiples del gen clonado

Hasta la década de 1980, el único método para obtener grandes cantidades de un fragmento de DNA era clonándolo en vectores adecuados e introduciéndolo y multiplicándolo en bacterias. En el año 1986, un investigador norteamericano, K. Mullis, desarrolló un método que permite, a partir de una muestra muy pequeña de DNA, obtener millones de copias de DNA in vitro, en unas pocas horas y sin necesidad de usar células vivas. Esta técnica, llamada reacción en cadena de la polimerasa (PCR), requiere conocer la secuencia de nucleótidos de los extremos del fragmento que se quiere amplificar. Estas secuencias se usan para diseñar dos oligonucleótidos sintéticos de DNA complementarios a una porción de cada una de las dos cadena de la doble hélice.

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

1. La mezcla de reacción contiene la secuencia de DNA que se quiere amplificar, dos oligonucleótidos sintéticos (P1 y P2) que servirán como cebadores, una DNA polimerasa termoestable (Taq) y los cuatro desoxirribonucleótidos trifosfato –dATP, dGTP, dCTP y dTTP–.
2. La mezcla de reacción se somete a ciclos sucesivos, cada uno correspondiente a una fase de desnaturalización, una de hibridación y una de elongación. Durante la desnaturalización, que se realiza por calentamiento de la mezcla a 95 ºC, se separan las dos cadenas del DNA molde.
3. Durante la hibridación, la temperatura de incubación se reduce para permitir el apareamiento de las bases de ambos cebadores en el sitio donde encuentran una secuencia complementaria.
4. Durante la fase de elongación, la mezcla se calienta a 72 ºC, temperatura a la cual la DNA polimerasa extiende la cadena complementaria a partir del extremo 3’ de los cebadores. Al finalizar cada ciclo, la cantidad de DNA molde disponible para el ciclo siguiente aumenta al doble.

Entre muchas de las aplicaciones que la PCR pone a disposición se encuentran la detección precoz o prenatal de enfermedades genéticas, la detección de infecciones virales latentes o la producción de grandes cantidades de fragmentos de DNA humano a una velocidad muy superior a la posible mediante otros métodos. Esta técnica también se aplica para estudios de identidad y filiación.

Aislamiento de fragmentos específicos de DNA

Localización de fragmentos específicos de DNA: hibridación

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