DNA recombinante: Las Herramientas del Oficio

Aislamiento de fragmentos
específicos de DNA
Obtención de
múltiples copias de DNA
Localización de
fragmentos específicos de
DNA: hibridación
Secuenciación del DNA
Biotecnología
Transferencia de genes

Las secuencias de nucleótidos de DNA reconocidas por tres enzimas de restricción ampliamente usadas: a) HpaI, b) EcoRI y c) HindIII.

Capítulo 16. DNA recombinante: Las Herramientas del Oficio

Aislamiento de fragmentos específicos de DNA

Los fragmentos específicos de DNA § se pueden obtener cortando moléculas de DNA con enzimas de restricción §, transcribiendo el mRNA § a DNA con la enzima transcriptasa inversa §, o por medio de la síntesis de oligonucleótidos en el laboratorio. Las enzimas de restricción se encuentran en la naturaleza en las células bacterianas y en algunos bacteriófagos §. Escinden las moléculas de DNA en secuencias de reconocimiento específicas, que típicamente tienen de 4 a 8 nucleótidos § de longitud. Su función en las células bacterianas es degradar moléculas de DNA extrañas. El DNA de la bacteria se protege de sus propias enzimas de restricción por la metilación de nucleótidos en las secuencias de reconocimiento.

Algunas enzimas de restricción producen cortes de la molécula de DNA que dejan extremos rectos. Otras cortan de manera escalonada, dejando extremos “pegajosos” que luego pueden unirse, por apareamiento de bases complementarias, con otros fragmentos producidos por la misma enzima. Esto hace posible combinar segmentos de DNA de fuentes diferentes.. Una misma molécula de DNA producirá distintos fragmentos, llamados fragmentos de restricción, si es tratada o digerida con diferentes enzimas de restricción. El gran número de enzimas de restricción y de secuencias de reconocimiento diferentes hace posible que se las utilice para empalmar segmentos de DNA genómico § de una variedad ilimitada de fuentes.

Las secuencias de reconocimiento de las enzimas de restricción frecuentemente tienen seis pares de bases de longitud y, cuando se leen en la misma dirección (por ejemplo 5' a 3'), las dos cadenas complementarias de la secuencia son idénticas; estas secuencias se denominan secuencias palindrómicas. Algunas enzimas como EcoRI y HindIII escinden el DNA dando como resultado extremos "pegajosos". Las enzimas de restricción generalmente se obtienen de bacterias y su nombre deriva del nombre científico de esas bacterias: HpaI es de Hemophilus parainfluenzae; EcoRI es de E. coli y HindIII es de Hemophilus influenzae.

Otra herramienta para obtener fragmentos específicos de DNA la transcriptasa inversa que fue aislada de ciertos virus que contienen genoma de RNA, los retrovirus §. Esta enzima es capaz de sintetizar DNA a partir de un molde de mRNA.

Cuando estos virus infectan una célula hospedadora, la transcriptasa inversa cataliza la síntesis de DNA a partir del molde de RNA viral; el mRNA viral, que codifica proteínas § virales, se transcribe a partir de este DNA, como también el RNA viral que será empaquetado en nuevas partículas virales. En el laboratorio, la transcriptasa inversa puede utilizarse para sintetizar DNA a partir de un molde de RNA, segmentos que se conocen como DNA complementario, o cDNA §.

Infección de una célula animal por un retrovirus.

En el esquema anterior se observa que

1. la cápside de un retrovirus está rodeada típicamente por una envoltura externa de lipoproteína formada por elementos de la membrana celular de su hospedador anterior y por proteínas virales. Esta envoltura puede fusionarse con la membrana celular de un nuevo hospedador, permitiendo que el virus entre en la célula.
2. Una vez que el retrovirus ha entrado en la célula, el RNA viral se libera de la cápside y
3. se transcribe a una única cadena de DNA complementaria (cDNA).
4. Comienza de inmediato la síntesis de la segunda cadena de DNA (complementaria a la primera), produciéndose una molécula de cDNA de doble cadena. Estas reacciones, así como la de degradación de la molécula original del RNA viral, son catalizadas por la enzima transcriptasa inversa.

El cDNA de doble cadena puede integrarse al cromosoma de la célula hospedadora. Posteriormente se transcriben, a partir del DNA viral integrado, tanto el nuevo RNA genómico viral como el mRNA para la síntesis de proteínas virales.

Para separar fragmentos de DNA menores de 500 nucleótidos se utiliza como matriz un gel de poliacrilamida.El tamaño de poro de este gel permite separar moléculas cuyo tamaño difiere en un solo nucleótido. Para separar moléculas de DNA de mayor tamaño, se utilizan matrices con poros mayores, como los geles de agarosa §, un polisacárido aislado de ciertas algas.

Los fragmentos de DNA separados no pueden ser visualizados directamente, por ejemplo, mediante el uso de técnicas de tinción.

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Obtención de múltiples copias de DNA

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