AUTOEVALUACIÓN - Capítulo 16. La genética molecular de los eucariotas

Cuestionario:

Distinga entre los siguientes términos: DNA genómico/cDNA; enzima de restricción/enzima metiladora, retrovirus/transcriptasa inversa.
Identifique las técnicas que forman las bases de la tecnología del DNA recombinante y dé una breve descripción de cada una.
¿Qué es la electroforesis? ¿Por qué es de tanto valor en los estudios de DNA recombinante?
¿De qué manera se protege el DNA de la bacteria de la acción de sus propias enzimas de restricción? ¿Por qué esta protección no se extiende al DNA extraño introducido a la célula?
Describa el papel de los extremos “pegajosos” en la tecnología del DNA recombinante. ¿Qué enzima se necesita para completar la recombinación?
Compare y contraste las características de los plásmidos, el bacteriófago lambda y los cósmidos, como vectores. ¿Cuáles son las ventajas del plásmido Ti como vector para introducir genes en las células de las plantas?
Suponga que usted trató una molécula de DNA con una enzima de restricción determinada y obtuvo cinco fragmentos que separó y clonó en copias múltiples. Usando las copias múltiples usted secuenció luego los cinco fragmentos. ¿Qué haría luego para establecer el orden de los cinco fragmentos en la molécula original?
Suponga que desea localizar en el cromosoma el gen que codifica una pequeña molécula de proteína. Usted conoce la secuencia de aminoácidos en la proteína y tiene la capacidad técnica para sintetizar una molécula de mRNA artificial con cualquier secuencia de nucleótidos que usted elija. ¿Cómo haría para localizar el gen? Suponga que desea separar el gen del resto del cromosoma. ¿Cómo procedería?
¿Por qué, en el proyecto de somatostatina, los investigadores unieron el gen de somatostatina sintético a elementos reguladores del operón lac? ¿Por qué incluyeron también el primer gen estructural del operón lac (el gen que codifica la beta galactosidasa) en el plásmido que fue introducido en las células de E. coli?
Las células de E. coli usadas en el estudio de DNA recombinante son “incapacitadas”, o sea, carecen de la capacidad para sintetizar componentes cruciales de sus paredes celulares, por ejemplo, o para hacer una base nitrogenada como la timina. En consecuencia, sólo son capaces de sobrevivir en el laboratorio, en un medio enriquecido. ¿Por qué los biólogos moleculares toman esta precaución?
¿Por qué la DNA polimerasa utilizada en PCR debe ser termoestable?

Respuestas:

1.Distinga entre los siguientes términos: DNA genómico/cDNA; enzima de restricción/enzima metiladora, retrovirus/transcriptasa inversa.

El DNA genómico es el DNA cromosómico que ha sido cortado en fragmentos de restricción por enzimas de restricción y luego clonado. El cDNA, o DNA complementario es el DNA transcripto del RNA por la enzima transcriptasa inversa y luego clonado; a diferencia del DNA genómico no contiene intrones.

Las enzimas de restricción protegen a las bacterias del DNA extraño que haya podido ingresar, incluso del de otras cepas bacterianas. Escinden el DNA sólo en secuencias de nucleótidos muy específicas, cuya longitud varía entre cuatro y ocho pares de bases. Estas secuencias se conocen como secuencias de reconocimiento, dado que son “reconocidas” por enzimas de restricción específicas. Las bacterias protegen a su DNA de sus propias enzimas de restricción añadiendo un grupo metilo (CH3) a uno o más de los nucleótidos de las secuencias de reconocimiento de su DNA. Esta metilación, que ocurre durante la replicación del DNA, es llevada a cabo por enzimas especiales, las enzimas metiladoras.

Los retrovirus son un tipo de virus animal que contiene RNA como material genético. Las células eucarióticas son hospedadoras de virus que contienen DNA o RNA como material genético. En algunos virus que contienen RNA, el RNA genómico actúa primero como molde para sintetizar una cadena complementaria de DNA. Esta síntesis es catalizada por una DNA polimerasa viral dependiente de RNA, conocida como transcriptasa inversa. Esta enzima también es la encargada de sintetizar la segunda cadena de DNA –que representa la secuencia del RNA molde original– y es complementaria, por lo tanto, a la primer cadena de DNA sintetizada. La molécula de DNA de doble cadena resultante se inserta en el genoma de la célula hospedadora. A partir de este DNA integrado se transcriben, subsiguientemente, tanto el nuevo RNA genómico viral como el mRNA para la síntesis de proteínas virales.

2.Identifique las técnicas que forman las bases de la tecnología del DNA recombinante y dé una breve descripción de cada una.

Las técnicas más importantes son:

a) Métodos de obtención de fragmentos específicos de DNA que permiten su análisis, y el aislamiento y manipulación de genes individuales. La obtención de fragmentos específicos puede ser realizado con enzimas de restricción, produciendo DNA genómico, con la transcriptasa inversa, produciendo cDNA o a través de síntesis de oligonucleótidos en el laboratorio. Los fragmentos de DNA pueden ser separados, de acuerdo a su tamaño, por medio de la técnica de electroforesis en gel.

b) Métodos de obtención de múltiples copias de fragmentos idénticos de DNA, como la clonación y la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La clonación se realiza por medio de transportadores (vectores) por medio de los cuales el fragmento de DNA de interés puede ser incorporado al interior de las células bacterianas. A medida que la célula y los vectores se replican, se obtienen múltiples copias del fragmento. Otro método que permite, a partir de una muestra muy pequeña de DNA, obtener millones de copias de DNA in vitro, en unas pocas horas y sin necesidad de usar células vivas es la llamada reacción en cadena de la polimerasa (PCR). El método se basa en la repetición cíclica de tres reacciones sucesivas. Al cabo del primer ciclo de tres reacciones, el fragmento de DNA elegido se ha duplicado y, por lo tanto, se ha duplicado la cantidad de DNA molde disponible para el segundo ciclo; lo mismo ocurre transcurrido cada ciclo de replicación.

c) Localización e identificación de fragmentos específicos de DNA, o de RNA, por hibridación de ácidos nucleicos, método que también permite estimar similitudes entre ácidos nucleicos de orígenes diferentes. Esta técnica aprovecha las propiedades de apareamiento de las bases de los ácidos nucleicos. Si se somete al DNA a alta temperatura o a un pH muy alto, los puentes de hidrógeno que mantienen unidas a las dos cadenas se rompen. Cuando se enfría lentamente la solución, los puentes de hidrógeno vuelven a formarse, reconstituyendo la doble hélice. Cuando se mezclan DNA desnaturalizados de fuentes diferentes, las colisiones al azar que se producen permiten que dos cadenas que poseen secuencias complementarias, aunque sea sólo en parte, se encuentren y que formen una doble hélice híbrida. El grado y la velocidad con que se reasocian los segmentos de las dos muestras suministra una estimación de la similitud entre sus secuencias de nucleótidos.

d) Secuenciación del DNA, es decir, determinación del orden exacto de los nucleótidos en un segmento de DNA, lo que permite, en consecuencia, una “lectura” directa de la información genética codificada. Actualmente se usan dos técnicas principales de secuenciación: una implica métodos enzimáticos y la otra métodos químicos. La secuenciación depende de la disponibilidad de copias múltiples de un fragmento de DNA, obtenidas por clonado de un segmento producido por digestión con enzimas de restricción o por la técnica de PCR.

e) Ingeniería del DNA o ingeniería genética, mediante la cual es posible modificar una secuencia de DNA para generar nuevas versiones de genes que pueden ser luego reintroducidas en una célula u organismo.

3.¿Qué es la electroforesis? ¿Por qué es de tanto valor en los estudios de DNA recombinante?

La electroforesis es una técnica de separación de una mezcla de moléculas orgánicas. Los fragmentos de DNA pueden ser separados por medio de esta técnica. El DNA se “siembra” en un extremo de una cuba que contiene una matriz porosa en forma de gel. Al aplicar una corriente eléctrica a través de esa matriz, las moléculas de DNA, que están cargadas negativamente, se desplazan hacia el polo positivo. La velocidad con la que los fragmentos de DNA se mueven en el gel por acción del campo eléctrico es inversamente proporcional a su tamaño. Los fragmentos luego pueden ser purificados y usados para su estudio y/ o manipulación.

4.¿De qué manera se protege el DNA de la bacteria de la acción de sus propias enzimas de restricción? ¿Por qué esta protección no se extiende al DNA extraño introducido a la célula?

Las bacterias protegen a su DNA de sus propias enzimas de restricción añadiendo un grupo metilo (CH₃) a uno o más de los nucleótidos de las secuencias de reconocimiento de su DNA. Esta metilación, que ocurre durante la replicación del DNA, es llevada a cabo por enzimas especiales. El DNA extraño que entra en la célula no es metilado por estas enzimas y, por lo tanto, no está protegido de la acción de las enzimas de restricción.

5.Describa el papel de los extremos “pegajosos” en la tecnología del DNA recombinante. ¿Qué enzima se necesita para completar la recombinación?

Los extremos pegajosos son una cadena de bases no apareadas al final de la doble cadena del DNA que hacen posible combinar moléculas de DNA de diferente origen. Si dos segmentos de DNA tienen extremos pegajosos complementarios, por ejemplo, como resultado del corte por la misma enzima de restricción, pueden volver a aparearse entre sí cuando se forman espontáneamente puentes de hidrógeno entre bases complementarias. La enzima DNA ligasa forja un nuevo enlace azúcar-fosfato entre los extremos de cada cadena.

6.Compare y contraste las características de los plásmidos, el bacteriófago lambda y los cósmidos, como vectores. ¿Cuáles son las ventajas del plásmido Ti como vector para introducir genes en las células de las plantas?

Los plásmidos y los bacteriófagos lambda son moléculas de DNA que se autorreplican en presencia de las enzimas necesarias y nucleótidos. Pueden ser transferidos de la célula bacteriana a otra célula tanto en el laboratorio como en la naturaleza. Ambos pueden ser usados como vectores para transportar fragmentos de DNA extraño en células bacterianas. Así ese fragmento puede ser clonado. Los plásmidos pueden generalmente ser usados para transportar segmentos de DNA no mayores de 10.000 pares de bases. Para clonar segmentos de DNA más grandes, de hasta 20.000 pares de bases de longitud, pueden utilizarse como vectores bacteriófagos lambda especialmente modificados. Para clonar segmentos aun mayores de DNA se usan los cósmidos. Los cósmidos contienen un origen de replicación de plásmido, un gen de resistencia a antibiótico y las secuencias COS en sus extremos, lo que permite la inserción de fragmentos de DNA de 35.000 a 50.000 pares de bases. Las regiones COS del lambda son sitios de reconocimiento para la enzima que corta el DNA recién sintetizado en cromosomas virales individuales que luego son empaquetados en sus cubiertas proteínicas. Dos regiones COS están separadas por 35.000 a 50.000 pares de bases, que es la distancia que separa estas secuencias en el genoma del fago lambda. Una vez construidos, estos vectores son convenientemente empaquetados por la enzima viral en un sistema in vitro, en el cual están presentes las cubiertas proteínicas de lambda vacías que les permitirán entrar a la célula bacteriana. Una vez en el interior, los cósmidos con el DNA insertado comienzan a multiplicarse como si fueran plásmidos. Las ventajas del plásmido Ti como vector para introducir genes en un planta son varias. En primer lugar, el plásmido Ti y la célula bacteriana en la que reside son capaces de entrar a la planta sin ninguna intervención humana. En segundo lugar, una vez incorporado a la célula hospedadora, sus genes pueden ser expresados, nuevamente, sin intervención humana. En tercer lugar, si se incorpora el gen de la luciferasa en el plásmido Ti se puede saber si el gen realmente ha sido introducido en la nueva célula hospedadora y, si una vez transferido, está dirigiendo la síntesis de proteína. La luciferasa proporciona claramente una señal extraordinaria de que realmente ha ocurrido la transferencia del gen: las plantas resplandecen.

7.Suponga que usted trató una molécula de DNA con una enzima de restricción determinada y obtuvo cinco fragmentos que separó y clonó en copias múltiples. Usando las copias múltiples usted secuenció luego los cinco fragmentos. ¿Qué haría luego para establecer el orden de los cinco fragmentos en la molécula original?

Una vez secuenciados los fragmentos de la molécula de DNA producidos por medio de una enzima de restricción particular, se pueden cortar copias del DNA original con una enzima de restricción diferente que actúa en una secuencia de reconocimiento diferente. Se puede luego secuenciar los fragmentos resultantes. Comparando ambos grupos de datos y analizando las regiones superpuestas en los dos grupos de fragmentos secuenciados, se puede determinar cómo los segmentos encajan juntos en la molécula de DNA original.

8.Suponga que desea localizar en el cromosoma el gen que codifica una pequeña molécula de proteína. Usted conoce la secuencia de aminoácidos en la proteína y tiene la capacidad técnica para sintetizar una molécula de mRNA artificial con cualquier secuencia de nucleótidos que usted elija. ¿Cómo haría para localizar el gen? Suponga que desea separar el gen del resto del cromosoma. ¿Cómo procedería?

Para localizar el gen que codifica una proteína determinada, primero se podría usar la secuencia de aminoácidos conocida de la proteína para determinar la secuencia de nucleótidos de mRNA de la cual esa proteína pudo haber sido traducida. Luego, se puede sintetizar ese mRNA usando nucleótidos radiactivos. Luego se puede calentar una molécula de DNA para disociar la doble hélice, adicionar el mRNA radiactivo y permitir que se hibriden por enfriamiento. La secuencia de DNA con la cual el mRNA hibridiza será el gen de interés. Para separar del gen del resto del cromosoma se debería proceder por alguno de los siguientes caminos. Se puede tratar el cromosoma con una enzima de restricción, introducir el fragmento en vectores apropiados, introducir los vectores en colonias de bacterias, transferir las colonias con un filtro especialmente preparado y usar la sonda radiactiva para identificar las colonias en las que la secuencia de DNA de interés ha sido clonado. Luego se pueden cultivar los vectores y purificar los fragmentos de DNA. Alternativamente, se podría hibridizar primero el mRNA de su sonda con DNA intacto y luego tratar la muestra con enzimas de restricción. Luego se puede separar los fragmentos usando la técnica de electroforesis y usar su sonda radiactiva para identificar los fragmentos contenidos en el gen.

9.¿Por qué, en el proyecto de somatostatina, los investigadores unieron el gen de somatostatina sintético a elementos reguladores del operón lac? ¿Por qué incluyeron también el primer gen estructural del operón lac (el gen que codifica la beta galactosidasa) en el plásmido que fue introducido en las células de E. coli?

Los investigadores unieron el gen sintético para la somatostatina con los elementos regulatorios del operón lac para crear un sistema que “encienda” el gen, es decir, para crear un mecanismo por el cual se pueda iniciar la transcripción y traducción del gen sintético. Incluyeron el primer gen estructural del operón lac para que la proteína extraña pueda ser “camuflada” como una de las proteínas normalmente presentes en las células bacterianas y, así, ser protegido de las enzimas bacterianas que degradan proteínas extrañas.

10.Las células de E. coli usadas en el estudio de DNA recombinante son “incapacitadas”, o sea, carecen de la capacidad para sintetizar componentes cruciales de sus paredes celulares, por ejemplo, o para hacer una base nitrogenada como la timina. En consecuencia, sólo son capaces de sobrevivir en el laboratorio, en un medio enriquecido. ¿Por qué los biólogos moleculares toman esta precaución?

E. coli es un habitante normal de tubo digestivo de muchos animales, incluidos los humanos, y puede transferir plásmidos entre ellos mismas o a otro tipo de células bacterianas. El incapacitar células de E. coli que son usadas en el laboratorio en estudios de DNA recombinante asegura que esas células no puedan sobrevivir fuera de condiciones especiales. Específicamente, esto asegura que esas células no puedan infectar a humanos u otros animales.

11.¿Por qué la DNA polimerasa utilizada en PCR debe ser termoestable?

El éxito de la técnica de PCR depende del uso de una DNA polimerasa termoestable que no sea desnaturalizada por los repetidos ciclos de calentamiento. Esta enzima fue originalmente aislada de la bacteria termófila Thermus aquaticus.

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